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  • NCI-H1385细胞复苏人肺癌 "

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    购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,原因比较复杂,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳;血清使用错误或血清的品质不佳;解冻过程错误;冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心;悬浑细胞误认为死细胞;培养温度使用错误;细胞置于-80℃太久等。建议严格参照ATCC的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。

    欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?欲回收动物细胞,其离心速率一般为300×g(约1OOOrpm),5-10分钟,转速过高或离心时间过长都将造成细胞死亡。合适的离心转速是根据相对离心力决定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2,其中r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离;rpm为离心机每分钟的转数;RCF(relative centrifugal force)为相对离心力,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍数来表示单位。

    为什么培养的细胞要及时传代?体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性,也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候,它就会停止生长,及时传代后,细胞的生长得以继续。

    培养细胞生长减慢的原因在哪些?其解决办法有哪些?可能的原因有:更换了不同的培养液或血清;培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨眈肢或生长因子等耗尽或缺乏或己被破坏;培养物中有少量细菌或真菌污染;试剂保存不当;比较新培养液与原培养液成分,比较新血清与旧血清等,找出其它可能的原因。

    解决办法:增加起始培养细胞浓度;让细胞逐渐适应新培养液;换入新鲜配制培养液;补加谷氨酷肢或生长因子等;用无抗生素培养液培养,如发现污染,去弃培养物,或用抗生素除菌;血清需保存在5℃到20℃; 培养液需在2-8℃避光保存;含血清完全培养液在2-8℃保存,并在2周内用完;分离培养物,检测支原体。

    冷冻管应如何解冻?取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1-2分钟内大部分融化,特别注意,需残留一小块冰块,就可拿到超净工作台操作细胞,用75%酒精消毒冻存管,用新鲜培养基将细胞转移至培养瓶。另外冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管爆裂。" "

    传代细胞培养:原代细胞或细胞株或细胞系需在体外持续地培养就必须传代,以便获得稳定的原代细胞或细胞株或细胞系或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续,这个过程体外培养称为传代细胞培养。一般认为,细胞培养形成单层汇合,细胞密度与生存空间有密切的关系,将培养细胞分散,以1:2或l:3或1:4以上的比率转移分散进行培养,即为传代细胞培养。细胞传代后,一般经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。

    常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度,即细胞群的分裂相数/100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2%~0.5%,肿瘤细胞可达3~5%。细胞接种2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好时期,称指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。

    传代细胞的培养:(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基(以25mL培养瓶为例)。(2)每瓶加入2mL,无钙、镁PBS,漂洗一次后倒掉。(3)每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液),轻轻摇动培养瓶,经消化液铺满所有细胞表面,待细胞层略有松动,肉眼可观察到“薄膜”现象时,倒掉消化液,再继续作用2~3分钟,轻轻摇动,细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来,在显微镜下可发现细胞回缩变圆,细胞间隙增大,此时应立即终止消化。(4)加入完全培养基5mL,用吸管反复吹打瓶壁上的细胞,吹打时要按顺序进行,以确保所有瓶壁均吹打到,吹打时动作要轻柔,不要用力过大,尽可能不要出现泡沫,以避免细胞的机械损伤。(5)用计数板计数,计算细胞的浓度,并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。

    传代细胞的建系和维持

    1、细胞档案:细胞档案要记录好,如组织来源、生物学特性(由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等)、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间(分裂指数),细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等,这些记录对于保证细胞的正常生长,保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较,都有十分重要的意义。

    2、换液传代:(1)细胞系的传代、换液方法与前相同,但一般都有自身的规律性,因而在继续传代时,要注意保持其稳定的规律性,这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变,给以后的实验带来影响。(2)多种细胞系维持传代,要严格操作程序,对所用的试剂各系不能交叉。每传5代后,细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录,培养瓶上要有明显标记,标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失,而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异,此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。" NCI-H1385细胞复苏人肺癌 "

    传代培养及其操作步骤:原代细胞培养成功以后,需要进行分离培养,否则细胞会因生存空间不足或密度过大,营养障碍,影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株),可以进行细胞克隆,易于保存,但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料,便于实验。

    传代细胞培养操作步骤:(1)吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。(2)向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。(3)置37℃孵箱或室温(25℃温度)下进行消化,2-5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察,当发现胞质回缩、细胞间隙增大后,应立即中止消化。(4)吸出消化液,向瓶内加入Hanks液少量,轻轻转动培养瓶,把残留消化液冲掉,然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培养液,终止消化。(5)使用弯头吸管,吸取瓶内培养液,按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔,以防用力过猛损伤细胞。(6)用计数板计数后,分别接种于新的培养瓶中,置CO2培养箱中进行培养。(7)细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2-3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面,即可使用;也可继续传代扩大培养或换成维持液。

    传代细胞培养注意事项:(1)掌握好细胞消化的时间,消化时间过短时,细胞不宜从瓶壁脱落,过长的消化会导致细胞脱落、损伤。(2)掌握好消化浓度,当消化液浓度过高时,消化时间应缩短,过低时细胞消化时间相对延长。

    体内细胞培养及其操作步骤:瘤细胞悬液接种(1)无菌选取生长良好(有光泽,淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。(2)在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨,经80~100目筛网过滤成细胞悬液。(3)培养细胞应用PBS洗两遍。(4)计数并调整细胞浓度至10(7)~10(8)/ml。(5)常规消毒后,于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml/部位,>10(6)细胞)。初次接种成功率低,细胞数尽可能多一些。(6)次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期,以后随着传代潜伏期逐渐缩短,最后固定为一个相对稳定的时间。

    腹水瘤的建立与腹水瘤的接种:将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位,引起腹水,腹水中含有瘤细胞,将这种腹水反复传代,即可成为腹水瘤。初次传代时,腹水常呈血性(含大量红细胞),反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。(1)将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤,进行细胞计数。(2)消毒动物,左下腹穿刺接种1×10(6)腹水瘤细胞。(3)接种腹水瘤细胞后约7-12d,待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,用9号针头抽取腹水,也可行腹部解剖后,用滴管吸取。每只小鼠可抽3-5ml。(4)抽取的腹水经3000rpm离心15min,收集上清,分装冻存备用。

    培养细胞的冻存及复苏:细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中,储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。

    冻存细胞:(1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染),在冻存前1d换液。(2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×10(7)/ml左右密度,离心,去上清。(3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜(DMSO) 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。(4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m悬液。(5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,做好标记。(6)冻存:在特殊的仪器或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min时间内,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。操作时应戴防护眼镜和手套,以免液氮冻伤。

    复苏细胞:(1)从罐中取出冻存管。(2)迅速放入36℃~37℃水浴,不时摇动,使其急速融化,30~60s内完成。(3)冻存管用70%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。(4)低速离心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培养液洗一次。(5)用培养液适当稀释后,装入培养瓶37℃培养,次日更换一次培养液后,继续培养。以后仍按常规进行培养。冻存细胞数量要充分,密度应达到10(7)/ml,在融后稀释20倍时,仍能保持5×10(5)/ml数量。" "

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